Terapia Epigenómica

 Terapia Epigenética en un modelo celular de isquemia cerebral

Tema: Suplemento enriquecido con polifenol ejerce una potente actividad de protección epigenética en isquemia cerebral.

Mecanismo epigenómico tratado: Histonas

Acetilación de histona H3 en el promotor de Bim

Acetilación de la lisina 310 (K310) en la subunidad NF-κB/RelA

Acetilación de las proteínas diana de la HAT (histona acetiltransferasa) o HDAC (histona desacetilasa)

Como se hizo:

El estudio se realizó utilizando un modelo celular de isquemia cerebral en neuronas corticales de ratón. 

1. Cultivo celular: Cultivos primarios de neuronas corticales de ratón.

2. Exposición a la privación de oxígeno y glucosa (OGD): La duración de la exposición a OGD fue de 3 horas.

3. Tratamiento con la mezcla de micronutrientes polifenólicos (PMM): Esta mezcla contenía una variedad de componentes bioactivos, incluyendo: epigalocatequina-3-galato (EGCG), y otros micronutrientes. 

4. Análisis de viabilidad celular: Medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo. 


5. Análisis de Western blot (WB):  Modificaciones postraduccionales de las proteínas nucleares.

Resultados:

Resultados a corto plazo (24 horas después de la privación de oxígeno y glucosa - OGD):

• Efecto neuroprotector inmediato contra el daño celular inducido por la isquemia cerebral simulada.

Resultados a mediano plazo (48 horas después de la OGD):

• Disminución significativa en la acetilación de histonas en el promotor del gen proapoptótico Bim en las células tratadas con PMM en comparación con las células no tratadas.

Resultados a largo plazo:

• La neuroprotección inducida por la PMM  podría contribuir a la recuperación y la supervivencia celular a largo plazo después de un evento de isquemia cerebral.

Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/330922976_A_Polyphenol-Enriched_Supplement_Exerts_Potent_Epigenetic-Protective_Activity_in_a_Cell-Based_Model_of_Brain_Ischemia

Referencias:

1. Faggi L, Porrini V, Lanzillotta A, Benarese M, Mota M, Pizzi M, Parrella E. A Polyphenol-Enriched Supplement Exerts Potent Epigenetic-Protective Activity in a Cell-Based Model of Brain Ischemia. 2019. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/330922976_A_Polyphenol-Enriched_Supplement_Exerts_Potent_Epigenetic-Protective_Activity_in_a_Cell-Based_Model_of_Brain_Ischemia

Técnicas de Edición de Acidos Nucléicos

CRISPR-Cas9 en la modificación genética de Fibrosis Quística

Tipo de Edición: ex vivo, células somáticas (fibroblastos)
Dirigido hacia: genes (corregir la mutación del gen CFTR)
Dirigido por: CRISPR-CAS9
Órgano a tratar: células epiteliales respiratorias
Vía de administración: Parenteral (intravenosa)
Resultados a corto plazo  Se demostró que la corrección de la mutación del gen CFTR había sido realizada con éxito al observar un incremento en las corrientes de cloruro. 

Resultados a mediano plazo: Se determinó que en las células corregidas se encuentra una modificación post tradicional que no estaba cuando el gen se encontraba mutado. Esta modificación resulta importante ya que permite que el CFTR se pueda adherir a la membrana plasmática, dado que, en ausencia de esta, la proteína permanece en el citoplasma, donde va a ser degradada.

Resultados a corto plazo: La evolución dirigida de CRISPR-Cas9 permitirá una mejora más refinada en la construcción de herramientas de próxima generación para promover innovaciones en cuanto a las técnicas de edición genómica.

 El sistema CRISPR-Cas se basa en dos componentes principales: un ARN guía (ARNg) y una nucleasa asociada a CRISPR (Cas). Disponible en: CRISPR/ Cas9 COMO HERRAMIENTA DE EDICIÓN GENÉTICA: LÍMITES ACTUALES Y APLICACIONES REALES. 2019 - Fernando Galán Galán (fernandogalangalan.com)

Referencia:

1. Castillo K. CRISPR-Cas9 en la modificación genética de Fibrosis Quística. CS [Internet]. 31 de enero de 2020 [citado 18 de febrero de 2024];4(1):Pág. 2-3. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/339038687_CRISPR-Cas9_en_la_modificacion_genetica_de_Fibrosis_Quistica

Terapia Regenerativa o Terapia Celular o Terapia con Stem Cells

Tratamiento regenerativo con células madre en la úlcera crónica por Dermolipectomía

Tipo de Steam Cell: células madre adultas: céulas mesenquimales provenientes de la gelatina de Wharton

Método de obtención: aislamiento celular mediante enzimas digestivas y cultivo celular

Vía de administración: De manera intradérmica en los bordes y el lecho de lesión

Resultados a corto y mediano plazo:

Séptimo día de tratamiento: la lesión mostró reducción de su extensión, profundidad y grosor al presentar bordes mejor definidos, con una mayor extensión de piel en los márgenes y una capa celular superficial, típica señal de cicatrización; además, los sitios de toma de biopsia se rellenaron rápidamente con tejido.

Por otra parte, el área abierta se redujo en 70% con una tasa de cierre más rápida en los primeros siete días del tratamiento, mientras que en la segunda aplicación el índice de úlcera se redujo hasta un 80%.

Resultado a largo plazo:

Mejoró la apariencia de la herida al igual que las condiciones que mantenían el estado persistente de la úlcera.

Se pudo observar que el tratamiento celular indujo un proceso de desbridamiento natural que facilita la fase proliferativa del proceso de cicatrización debido a la liberación in situ de factores como TNFα, IFNγ y IL-633, lo cual favorece el desplazamiento, atracción e infiltración de plaquetas y queratinocitos nativos que remodelan la zona de la lesión.

Lo anterior llevó a la reducción tanto del área como de la profundidad de la herida, en especial de los sitios donde se tomó la biopsia, lo que indicó regeneración, no se produjo rechazo inmunológico debido a que las CMM son de baja inmunogenicidad, y con propiedades inmunomoduladoras que no inducen la expresión del MHC clase II.

Referencias:

1. Mejía M., Cázares E., Guerra Á, Hernández G., Cáceres R., Gutiérrez. Tratamiento regenerativo con células madre mesenquimales provenientes de la gelatina de Wharton de cordón umbilical en la úlcera crónica por dermolipectomía. 2019 [citado 2024 Feb 11]. Disponible en: https://www.scielo.org.mx/pdf/cicr/v87s1/2444-054X-cir-87-S1-8.pdf

Ejemplo de ADN recombinante artificial y de Ácidos Nucleicos recombinantes en la naturaleza

 Ácidos Nucleicos recombinantes en la naturaleza

Maíz Bt de Monsanto, modificado genéticamente a través de la introducción de información genética de la bacteria Bacillus thuringiensis, que codifica la síntesis de toxinas capaces de matar a larvas de lepidópteros como la Spodoptera frugiperda, principal plaga de ese cultivo.

Maíz no Bt mostrando daño por parte de los insectos

ADN recombinante artificial en el virus de la Hepatitis B

Tema: Expresión de la proteína recombinante PreS2-S del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en Pichia pastoris

Objetivo: Diagnostico de Hepatitis B en pruebas ELISA

Gen a clonar: PreS2-S a 8707 pb y 8980 pb

Enzimas de restricción: BamHI/EcoRI y Xho I/EcoRI.

Enzima ligasa: ADN ligasa T4.

Vector: pPIC3.5 y XhoI/EcoRI para pPIC9

Célula receptora: Células electrocompetentes de E. coli Neb-5α (Célula Procariota: Transformación)

Método de inserción del gen: Método Físico: Electroporación

Método de identificación de clones: ELISA, WesternBlot, PCR, Inmunofluorescencia

Referencia:

1. Sasmakov SA, Ashirov ON, Abdurakhmanov JM, et al. Expresión de la proteína recombinante PreS2-S del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en Pichia pastoris. VacciMonitor. 2021;30(1):27-32. Obtenido de: https://www.redalyc.org/journal/2034/203467533005/203467533005.pdf

2. Ardisana E, Gaínza B, Torres A, Fosado O, & León R. (2019). Alimentos Transgénicos: ¿SÍ O NO? La perspectiva Sudamericana. Revista Chakiñan de Ciencias Sociales y Humanidades, (8), 148-157. Recuperado en 04 de febrero de 2024, de http://scielo.senescyt.gob.ec/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2550-67222019000200148&lng=es&tlng=es.

Hibridación in situ fluorescente (FISH) en el Instituto Nacional de Cancerología (INC) de Colombia.

Tomado de: https://www.revistacancercol.org/index.php/cancer/article/view/73/665#figures

Esta herramienta molecular detecta anomalías cromosómicas, tanto numéricas como estructurales. Para el análisis del estudio se utilizaron muestras de médula ósea y sangre periférica, los resultados fueron divididos en neoplasias hematológicas y tumores sólidos. Las principales anomalías citogenéticas son trisomías y translocaciones (un oncogén de un cromosoma asociado se transloca a la región IgH en el cromosoma 14q32).

Referencia:

Tatiana R, Rafael P, Juan C, Gonzalo G. Hibridación in situ fluorescente (FISH) en el Instituto Nacional de Cancerología (INC) de Colombia. Experiencia de 5 años. Revista Colombiana de Cancerología. Marzo del 2019. Obtenido de: https://www.revistacancercol.org/index.php/cancer/article/view/73/665#info

Detección de citomegalovirus mediante PCR dúplex en tiempo real

Tema: Detección de citomegalovirus en plasma de pacientes con VIH  mediante PCR dúplex en tiempo real

Objetivo: Detectar y cuantificar el CMV mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) dúplex en tiempo real, a partir de una mínima cantidad de plasma.

Muestra: Plasma de pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

Tipo de Ácido Nucleico: ADN viral

Extracción:

Lisis: Uso de enzimas

Separación: electroforesis en un gel de agarosa al 2% con un marcador de DNA de 100 pb

Purificación: Uso del Kit QIAamp UltraSens Virus 

Gen a amplificar: genes UL122 y UL83 se amplificaron con diferentes fluoróforos mediante PCR dúplex en tiempo real.

Tipo de PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) dúplex en tiempo real

Pasos:

Desnaturalización: 95 °C por 15 minutos

Hibridación: 57 °C por 90 segundos

Elongación: 72 °C por 10 minutos

Visualización: de los plasmas de pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con una carga viral ≥ 100,000 copias/ml, el 11.36% fueron verdaderos positivos para CMV y el 88.64% no tuvieron amplificaciones o estuvieron fuera del rango lineal de detección molecular.

Obtenido de: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=457767703013

Referencia:

1. Valdez-Salazar H. A, Sánchez-Nájera N, Ribas-Aparicio R. M, Pompa-Mera E. N, Mata-Marín J. A, Gómez-Delgado A, Aguilera P, , Ruiz-Tachiquín M. E.  Detección de citomegalovirus en plasma de pacientes con VIH mediante PCR dúplex en tiempo real. Revista Médica del Instituto Mexicano del Seguro Social [Internet]. 2020;58(2):154-160. Recuperado de: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=457767703013

Alteración de la Epigenética en el Covid-19

 

Los principales cambios epigenéticos asociados, involucran la hipometilación de las regiones promotoras de genes específicos, como el FKB5, el receptor de glucocorticoides, el receptor NMDA de glutamato, por lo que es posible que afecten la susceptibilidad a enfermedades y los patrones de comportamiento de las nuevas generaciones.



Referencias:

Mardones L. La herencia de la pandemia por Covid-19. Rev. Med. Chile (Internet). Junio 2020 (Obtenido el 06 de Diciembre del 2023); 148 (6): 881-882. Disponible en: https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-98872020000600881